流感抗體檢測怎麼看是否正常

在自己服用葯物之後一定要自己多加的休息，因為這樣才能夠保證自己在患流感性病毒感冒的時候，能夠有效的在醫生的治療下得到根治。因為這樣本身對於自身也是非常有好處的，在服用葯物之後一定要多加的休息盡早的治療，避免引發並發症。

E. 血清中禽流感抗體含量的檢測方法

禽流感是由A型流感病毒引起的一種高度接觸性傳染性疾病。給世界養禽業造成了巨大的經濟損失。禽流感病毒可分為不同的亞型，世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7兩種亞型引起，而人對其中的H1和H3亞型易感。快速診斷禽流感病毒具有重大意義。目前禽流感的實驗室檢測是比較快速、准確的方法。隨著血清學實驗技術和生物工程技術的飛速發展，禽流感診斷技術的研究也不斷取得新進展。瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗等常規方法的使用雖有一定的優勢，但免疫熒光法和ELASA也日益顯示出其快捷准確的特點：分子生物學的發展為核酸序列分析法的建立創造了條件,也使PCR，RT－PCR及核酸探針等檢測技術成為可能。這篇文章就是對有關該病的診斷方法加以總結，並提出了認為比較可行的改進方法，旨在方便對禽流感做出及時而有效的診斷並採取相應措施。

1. 病毒的分離鑒定

無菌採集病料經處理後接種9－11日齡雞胚，收取尿囊液測定血凝活性。若為陰性則應繼續盲傳2－3代。對具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫(ND)抗血清做血凝抑制(HI)試驗!以排除ND感染。然後用免疫擴散等方法來檢測特異核心抗原，核糖蛋白(NP)或基質蛋白(MP)，再用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時進行致病力試驗，確定毒力強弱。但是流感病毒「O」相毒株不凝集雞紅細胞，故近來在流感病毒鑒定中常用豚鼠或人紅細胞來代替。然而，該兩種細胞無細胞核，沉積慢，一般在紅細胞凝集及凝集抑制測定中需60分鍾才能觀察結果，同時在「U」型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點即當中常有小空[1]。

病毒的分離鑒定對禽流感的診斷比較確實,但操作程序繁瑣、費用多、耗時費力。

2. 血清學診斷技術

2.1 瓊脂擴散(AGP)試驗

進行病毒抗原型特異性鑒定即用已知陽性血清和末知抗原進行AGP試驗。

受檢樣品是具有血凝素活性的雞胚尿囊液。AGP是用來檢測A型流感病毒群特異性血清抗體，即抗核糖蛋白(RNP)和基質蛋白(MP)抗體，因而適用於鑒定流感病毒 。1979年Beard首次將AGP用於禽流感抗體檢測[2]。

此法雖簡單易行，但是敏感性較差，易出現假陽性。AGP最常用的是免疫雙擴散，趙增連、陳海燕等分別開展了禽流感病毒快速定型雙擴散法的研究，不僅提高了其敏感度，且快速省時，在此方法基礎上建立的AGP診斷技術及其診斷試劑盒，在全國范圍內得到推廣應用，並取得良好的效果。

2.2 血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)

一般情況下，新分離毒株要先鑒定出特異性NP或.MP抗原型(用AGP)確定禽流感病毒，再做HA亞型的鑒定[3]。

現已有人採用改進HA試驗方法，稱為HA加敏法。該法測抗體效價比常規性高2－4倍，若抗原用乙醚裂解其敏感性比常規法高4－6倍，但觀察時以30min內為好，否則易出現假陽性。另外，還應注意在HI試驗時，應先除去特異性凝集反應。許多禽類血清都含有非特異性因子，能和紅細胞表面受體競爭性地作用於病毒表面的血凝素而發生非特異性凝集反應。通常用受體破壞酶(RED)即霍亂菌培養液處理法或高碘酸鈉法制備血清[4]。

HA、HI 特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費時，並且由於用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的禽流感病毒，所以用該方法鑒定不如瓊脂擴散實驗簡便和快捷。

2.3 神經氨酸酶抑制試驗(NIT)

根據A 型流感病毒的表面抗原特性,特別是血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)特性，不僅可通過HI試驗對病毒進行堅定，而且可通過NI試驗進行鑒定。1983 R.A.Van.Densen介紹了NI試驗的一種改進法－平板微量NI試驗，此法雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測的快捷方法， 試驗證明微量NI試驗能對分離物做出准確鑒定而常量NI試驗檢測亞型混合物似更敏感[5]。

目前國家獸醫實驗所已將微量NI試驗列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清9型NA抗體的常規方法，診斷中也已廣泛採用此法特別是美國在80年代火雞發生流感病毒期間，每次流行所得的血清樣本用微量NI試驗所作出的A型流感病毒亞型鑒定結果已為病毒分離、疫苗接種和流行病學資料所證實。這種方法已被證明是快速的且成本較低和有可重復性。這種技術的可靠性將導致NI試驗的廣泛應用。

2.4 中和試驗(NT)

病毒中和實驗技術是反映機體抵抗特定病毒感染能力的最可靠方法。流感病毒中和實驗技術有以下優點：（1）由於中和抗體作用於流感病毒表面血凝素蛋白（HA），使流感病毒失去感染能力，因此，流感病毒中和實驗主要用於檢測血清中的特異性抗血凝素蛋白抗體。（2）流感病毒中和實驗既能檢測病毒株的功能性變化，又能反映機體的抗病毒水平。（3）該方法主要使用感染性病毒，不需要進行病毒或病毒蛋白的純化，因此，可以被迅速用於檢測新病毒或人群免疫狀態[6]。

以中和試驗(NT)來鑒定或滴定流感病毒時常用雞胚或組織培養細胞，操作方法與其他病毒(如NDV)的中和試驗相同。病毒中和實驗技術是一個相當復雜的過程，參與中和反應的因素有病毒、抗血清和宿主細胞。這些因素的變化都會影響中和實驗的結果。因此，對中和實驗的整個過程進行嚴格的質量控制。每次測定必須設立陽性和陰性血清對照，陽性和陰性細胞對照，以及對病毒使用劑量進行滴定。

NT試驗是最敏感而特異的血清學方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應，特別是與吸咐到宿主細胞上的病毒表面抗原相對應，才能在實驗中取得滿意的顯示效果。 因此，某一個血清型的中和試驗抗體只與同組內地其他病原表現出有限的交叉反應。病毒中和試驗操作繁瑣耗時費料，臨床上幾乎不用。但作為經典方法在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的檢測方都要與之為標准進行比較[7]。

2.5免疫熒光技術(IFT)

免疫熒光技術就是熒光抗體技術(FAT)。 IFT早在1961年就開始用於人類流感的快速診斷。1984年濱西法尼亞州爆發禽流感時，Skeeles將IFT首次用於AIV的檢測。IFT最早用於病毒的鑒定和定位病毒感染細胞中特異性抗原。主要是核內熒光:用MP抗原的熒光抗體主要出現胞質熒光，核內也有部分熒光[8]。

用於禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法即在組織觸片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光 。一種AIV的熒光抗體可用來檢測不同亞型的其他病毒。

IFT用於診斷具有快速、簡便、敏感性好的特點，而且費用較低，其敏感度同病毒的分離鑒定相當，有時高於用雞胚進行的病毒分離。但是需要注意的是如何避免和降低標本中出現的假陽性(非特異性熒光)問題。

對一株雜交瘤細胞分泌的流感病毒的單克隆抗體進行檢測時，發現間接固相免疫熒光技術的敏感性比HI 高40－150倍。間接免疫熒光技術也可以用來檢測核蛋白(NP)基質蛋的(MP)抗原與抗體的反應，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進行裂解[9]。

2.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)

ELISA的基本原理是：酶結合物與相應抗體或抗原特異性結合，再遇酶底物時，在酶的強烈催化下使原來無色的底物產生化學反應，即形成有色的產物，便可用肉眼或分光光度計定量檢測其含量。該方法具有特異性、敏感性、快速性和簡易性等優點。在流感病毒微量中和實驗中，酶結合物（HRP標記的羊抗鼠IgG抗體）與存在於MDCK細胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白單克隆抗體復合物結合，HRP酶催化OPD，使無色底物形成橙黃色化合物，再由ELISA檢測儀測定吸光度值，從而獲得中和抗體滴度[11]。

1974年Jenning等首先用ELISA對注射流感病毒所產生的抗體消長規律進行了檢測。Lanbre認為ELISA的敏感性遠高於HI補給結合反應 。Meulemans(1987)對ELISA、AGP、HI檢測AIV抗體進行了比較研究。發現AGP和ELISA一樣均能檢測型特異性抗原(抗體)，但敏感性遠低於ELISA，HI適用於亞型的檢測，其敏感性不如ELISA。1993 年Shodihall用混合纖維素脂膜或硝酸纖維素膜代替微量反應板，建立了快速診斷的DAS－ELISA大大縮短了診斷時間，並可保留ELISA的特異性、敏感性，其結果又不需要特殊儀器分析、可用肉眼判定。

隨著分子生物技術的發展，中國農業科學院哈爾濱獸研所的李海燕等用表達禽流感病毒核蛋白的桿狀病毒感染S9昆蟲細胞，以其表達產物制備抗原，建立了以桿狀病毒系統表達的AIV核蛋白為抗原的禽流感間接(重組核蛋白)ELISA診斷技術(rNP－ELISA)確定了其最適工作條件，並對3138份雞血清進行了檢測。實驗證明rNP－ELISA與全病毒間接ELISA(AIV－ELISA)，AGP及HI的符合率分別為99.9%、97.8%、98.8%，並能100%檢出AGP陽性及疑似HI陽性的血清樣品。 這證明了rNP－ELISA是檢測A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量、快捷、經濟的血清學診斷技術[11]。

ELISA方法的敏感性和特異性與抗原的純度直接相關 。1984年Abraham等報道了抗原快速提純法，所需時間比常規法縮短10倍，並且研究結果表明應用提純抗原幾乎全部排除了假陽性反應。

目前美國Kiregard Reery和Labortories有試劑盒出售。ELISA成為AI流行病學普查及早期快速診的最有效和最實用的方法。

3 分子生物學技術

近年來，隨著現代生物技術的發展，分子生物技術已被大量應用於禽流感的快速診斷。

3.1聚合酶鏈反應(PCR)及反轉錄---聚合酶鏈反應(RT—PCR)

PCR是近來發展成熟起來的一種體外基因擴增技術，能在數小時內使DNA呈指數增加。已成功地用於多種病毒的基因檢測和分子流行病學調查等其檢測原理為：尋找傳染性因子的特異DNA序列。對待測樣品進行PCR擴增， 如果檢測出了相應的擴增帶，則判為陽性反應；反之，無擴增帶則為陰性反應。

鑒於引起致病的禽流感病毒多是H5和H9血清亞型，在PCR技術的基礎上，崔尚金等(1998)建立了一種直接檢測禽糞樣和雞胚尿囊液中AIV—H9亞型RNA的RT－PCR反應，並將此法與AGP和電鏡技術作了比較，結果表明引物的特異性決定了產物的特異性，並且該方法靈敏度高，檢測過程僅需8h左右，並且大大縮短了感染後的檢出時間。

應用毛細管PCR(15min30個循環)代替常規PCR(2.5個小時30個循環)以進一步縮短檢測時間的研究也已展開並進入更深入的領域，以期用於不同樣品(組織、組織液、分泌液、糞便等)的檢測，區分高致病力毒株和低致病力毒株與非致病力毒株，從而深入探討該方法在AIV的臨床早期診斷，流行病學調查及發病機制中的應用價值，為我國制定AIV的綜合防制措施做出貢獻[12]。

3.2 核酸探針技術/核酸分子雜交技術

這項技術是目前生物化學和分子生物學研究應用最廣泛的技術之一，是定性和定量檢測特異DNA或RNA的有力工具。

核酸探針技術的原理，在進行雜交時，用一種預先分離純化的已知DNA或RNA序列片段去檢測末知的核酸樣品，對作檢測用的已知DNA或RNA序列片段加以標記的片段就稱為核酸探針。作為核酸探針的DNA或RNA是各種病原微生物基因的一部分。 在變性分開的待檢DNA或RNA單鏈中加入與其有互補作用的核酸探針。探針在一定條件下就能與原來變性分開的DNA或RNA單鏈上的互補區段形成氫鍵，從而結合成雜交雙鏈，通過洗滌，除去未雜交上的標記物，然後進行放射自顯影，即可確定原待檢樣品有無與探針互補的DNA或RNA序列。

Bashiruddin等(1991)報道了擴增HA基因來分析致病毒株與非致病毒株的差異，證實了致病毒株與非致病毒株氨基酸的差異，顯示了本方法的應用前景[13]。

3.3熒光PCR法

利用生物學手段，用熒光PCR方法快速檢測禽流感病毒的方法已在北京通過專家鑒定，這一研究成果不僅在國內屬於首次，而且在國際上也屬於先進水平。它與國際標准方法雞胚病毒分離相比，不僅無需做雞胚病毒分離培養，而且時間也由原來最短的21d縮短為4h。

4 電鏡技術

由於流感病毒為正粘病毒，屬於形態特徵性強的病毒,因而可用電鏡技術來診斷。為提高禽流感的檢出率，除樣品制備技術外，取病料的部位和時間也是獲得准確檢驗結果的關鍵。病料的採集部位及取材時間應根據禽流感病毒在動物體內分布特徵及其感染特性而定[15]。

5 流感實驗室檢測中應注意的若干問題（高致病性流感病毒）

（1）禁止在同一實驗室，更不應在同一接種櫃中，同時處理接種未知臨床標本、已知陽性標本

（2）禁止在同一實驗室，同一時間處理，接種采自不同動物的標本；動物標本（如禽、豬等）必須與人的標本分別保存。

（3）接種後剩餘原始標本，尤其分離出病毒的標本需暫時凍存，有條件的應置-70℃或以下保存，以便需要時可進行復查，待分離物經國家流感中心鑒定完後方可處理掉。分離陰性的標本應隨時棄之。

（4）嚴禁實驗室交叉污染：在病毒分離時嚴禁設陽性對照及操作在人群中已消失的流感病毒。

（5）向國家流感中心送毒株時，量至少需5 ml，同時需自己保存一些，以便寄送過程發生意外時可繼續補送。

（6）流感病毒在-20℃～-40℃ 時不穩定，故不宜在此溫度下長期保存。

（7）雞胚中分離出的流感病毒，應盡量別在MDCK細胞上傳代。因當今國內所用的MDCK細胞屬腫瘤細胞系，一旦病毒通過它傳代就無法用於疫苗制備。

（8）寄送毒株時一定需附上送檢表。寄送毒株需及時，尤其鑒定不出的，異常的毒株應盡快向國家流感中心寄送。寄送時用快速直送國家流感中心[16]。

總結

使用常規方法檢測禽流感及其抗體仍是目前世界上普遍接受的方法。這些方法包括病毒的分離、瓊脂擴散實驗鑒定病毒和測定特異性的血清抗體，血細胞凝集及其抑制試驗鑒定病毒或血清抗體亞型。 採用雞胚中和試驗來鑒定病毒或血清抗體亞型也是一種可以接受的方法，但相對血凝抑制試驗較為麻煩。隨著科學技術的發展，檢測該病毒和血清的方法出現了免疫光法和ELISA法，這些方都有快捷的特點，特別是日益完善並趨向成熟的ELISA檢測方法,因其簡捷、敏感、特異性強等優點而越來越得到廣泛的重視和應用。隨著分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法,特別是它能從分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法，特別是它能從分子水平揭示HPAIV甚至潛在HPAIV毒株。這種方法雖然在一般實驗室還不能應用,但RT－PCR技術為從基因水平檢測禽流感病毒RNA提供了靈敏、特異和快捷准確的方法。正在進行的應用毛細管PCR代替常規PCR，以進一步縮短檢測時間的研究和根據禽流感NP的高度保守性而建立的rNP－ELISA檢測法，不僅具有與AGP、HI同樣的特異性，而且具有更高的靈敏性，可在微克水平上進行檢測!都是很有前途的方法。將rNP－ELISA檢測技術及其成套的成品試劑組裝成診斷試劑盒，也取得了很好的實驗效果。

在以上各種檢測方法及科學技術發展的基礎上，將PCR技術與ELISA技術結合起來，建立一種新的實驗室檢測AIV的方法，將有較大的研究價值其實。其實驗原理（以此類方法中最簡單的雙引物雙標記法為例）如下：

PCR的一對引物中!其中一種引物用生物素標記，另一種引物用地高辛標記，酶標微孔板上用生物素的親和素包被(生物素的親和素與生物素特異的結合)。PCR擴增後純化片段加入微孔板中。此時，微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結合，從而形成生物素親和素－生物素－PCR片段地－高辛－抗地高辛－酶的復合物。加入酶的相應底物進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。由於該方法是PCR技術和ELISA技術的結合，所以它是一種兩級放大系統,即PCR放大和ELISA放大。故而它的靈敏度更高，同時這種方法避免了PCR產物分析時的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便、靈敏。

F. 怎麼判斷得了流感

流感可以通過以下幾個方面來判斷：
一，流行病學史，在流行季節如果一個單位或地區出現大量的上呼吸道感染的患者，或者是醫院的門診發現上呼吸道感染的患者明顯增加時就要注意有無流感的存在。
二，此時患者臨床症狀是以急性疾病，伴有畏寒、高熱的現象，患者頭痛、頭暈、全身的肌肉酸痛症狀多比較明顯，還可以伴有明顯的乏力、納差等不適，患者鼻塞、流鼻涕、打噴嚏的症狀可能相對於較輕，可以伴有咽喉疼痛和偶有咳嗽的症狀。如果繼發了下呼吸道感染，此時咳嗽、咳痰的症狀可能會進一步的加重。
三，患者早期完善實驗室的檢查，外周血常規白細胞計數多是在正常范圍或有不同程度的下降。此時病原學的檢查，對其呼吸道標本進行特異性的抗原或其基因的檢測。還可以對其相應的血清學檢查，例如疾病初期和恢復期雙份血清抗流感病毒抗體滴度有4倍或以上升高時，亦提示有流感的存在。

G. 禽流感抗體檢測結果是合格率百分之70是什麼意思

百分之30對抗體沒反應

H. 流行性感冒診斷標准及處理原則的診斷標准

流行病學史
在流行季節一個單位或地區同時出現大量上呼吸道感染病人；或近期內該地區或鄰近地區上呼吸道感染病人明顯增多；或醫院門診上呼吸道感染病人明顯增多。
病原學診斷方法
A1 病毒分離
從疑似流感病人呼吸道採集標本分離病原體。
A2 標本的收集和處理
A2.1 標本收集時間應於發病早期（1～3d內）越早越好。
A2.2 標本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用於採集兒童標本，採集時將滅菌棉拭子稍沾標本收集液（pH7.2～7.6含20%～40%滅菌肉湯的生理鹽水或Hanks液或生理鹽水），反復擦拭患者咽部數次，然後將此棉拭子放進裝有上述收集液的試管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用於採集成人標本，採集時先讓患者咳嗽，然後用10mL左右的收集液反復洗漱咽喉部約1min，吐入管內。如有條件，兒童標本用負壓抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人標本用鼻咽洗液，可提高分離的陽性率。標本採集後置冰壺（4℃）中盡快送實驗室。
A2.3 標本的處理：用毛細吸管反復吹打標本液（如為咽拭子標本，先反復擠壓咽拭子後棄之），將粘液打散，於4℃靜置5～10min，待自然沉澱後取3mL上清，按每毫升加青黴素1000單位和鏈黴素1000μg，混勻置4℃處理2～4h即可接種。如標本污染較重，可置4℃過夜處理。如預計標本在48h內不能完成接種時，應將標本置低溫（最好-70℃）保存。
A3 接種及培養法
最常用雞胚培養法和組織培養法，有條件的亦可同時用兩種方法進行病毒分離。
A3.1 雞胚培養法：取9～11日齡雞胚，將處理過的標本液經羊膜腔和尿囊腔各接種0.2mL，每份標本接種3～4隻胚，置33～35℃溫箱培養3d，然後將雞胚放置4℃冰箱過夜（或置—20℃冰箱1h再置4℃數小時）可分別收獲尿液和羊水，並作初步血凝（其方法是用毛細吸管取1～2滴尿液或羊水，置大孔塑料板內，再加入1～2滴1%雞紅細胞，搖勻後置室溫或4℃30～45min觀察結果，根據血球凝集程度的不同可分為++++、+++、++、+、±、－），如血凝為+++～++++時，再按系列倍比稀釋測定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鑒定。如血凝陰性，可盲傳2代，如仍為陰性則棄之。
A3.2 組織培養法：用0.2mL處理過的標本液接種於長成單層的原代人胚腎（或猴腎或地鼠腎），或狗腎傳代細胞（Madin Darby Canine Kidney，MDCK），每份標本接種4管，置37℃吸附1～2h後棄標本液，再加入每毫升含2μg胰酶的199維持液1mL，於33℃培養7～10d，並逐日觀察病變。從第三天開始每隔一天用0.4%雞或豚鼠紅細胞對培養管做紅細胞吸附試驗（試驗前無菌法收獲細胞培養上清液），如陰性則用已收獲的上清液盲目傳代，如陽性則測定上清液的血凝滴度。如標本第1代紅細胞吸附試驗陰性，可用收獲的全部上清液混合進行盲傳2代，仍為陰性則棄之。
A4 新分離株的鑒定
新分離流感病毒可用血凝抑制、補體結合、中和以及血細胞吸附抑制等試驗方法進行鑒定。最常用和最簡單的方法是血凝抑制試驗，必要時採用補體結合試驗。
A4.1 血凝抑制試驗：用當前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清與新分離流感病毒做血凝抑制試驗，觀察新分離株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制試驗方法見附錄B。
A4.2 紅細胞吸附抑制試驗：取紅細胞吸附試驗陽性的組織培養管和正常細胞對照管，用Hanks液洗細胞2次，加入經霍亂濾液（RDE）處理（1∶10）的免疫血清0.2mL，再加入Hanks0.6mL，室溫作用30min後，再加入0.4%雞（或豚鼠）紅細胞0.2mL，置室溫30min後於普通光學顯微鏡下觀察有無血球吸附。如果血細胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分離的病毒與所用免疫血清型別相一致或接近。
A4.3 補體結合試驗：如果用已知的甲型（甲3、甲1）或乙型或丙型流感病毒免疫血清對新分離病毒的血凝均不能抑制，則應考慮可能為甲型流感病毒的新亞型，可用針對甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作補體結合試驗定型。
血清學診斷方法
B1 血凝抑制試驗方法
B1.1 原理
一些動物紅細胞（如雞、豚鼠等）以及人「O」型血紅細胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產生紅細胞凝集現象，簡稱血凝。若將特異性抗體與流感病毒（血凝素）預先作用後再加入紅細胞則不產生凝集，稱為血凝抑制現象。用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用後，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為血凝抑制抗體效價。
B1.2 主要材料
大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。
B1.3 雙份血清收集及處理
急性期血清於發病3d內採取，恢復期血清於發病後2～4周採取。取0.1mL已分離的血清加入0.9（或0.4）mL霍亂濾液（RDE）（即1∶10或1∶5稀釋）搖勻，於37℃水浴中過夜，以去除血清中的非特異性抑制素，次日置56℃水浴50min以滅活多餘的RDE。
B1.4 流感病毒血凝素制備
流感病毒接種雞胚後48h收獲的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。為了延遲尿鹽沉澱可先用無菌生理鹽水做等量稀釋，置4℃備用。
B1.5 雞紅細胞懸液的制備
從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存於阿氏（Alsevr's）液中，置4℃保存。用前以生理鹽水洗3次，末次經2000r/min離心10min，將紅細胞用生理鹽水配成1%濃度。
B1.6 血凝素滴定
將流感病毒血凝素在大孔塑料板內用生理鹽水從1∶5開始做系列倍比稀釋，每孔0.25mL再加入等量1%雞紅細胞，搖勻，置室溫或4℃30～45min後觀察結果，以出現十十血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價，即為1個血凝單位，實驗時採用4個血凝素單位，例如血凝素效價為1∶320，為1個單位，4個單位即為1∶80稀釋。正式實驗前經校對取4個血凝單位用於實驗。
B1.7 血凝抑制試驗步驟
B1.7.1 將上述已處理的待檢血清（1∶10或1∶5）再用生理鹽水做系列倍比稀釋，每孔加0.25mL。
B1.7.2 加入等量已配好的4個單位血凝素。
B1.7.3 每孔加入0.25mL 1%雞紅細胞，搖勻置室溫或4℃30～45min。
B1.8 結果觀察
觀察結果時將血凝板傾斜數十秒鍾，待陰性孔內紅細胞自由下滑呈淚滴狀時讀結果。以出現完全抑制的血清最高稀釋度的倒數為抗體的效價。在檢測患者雙份血清時需在同一次試驗中進行，並以恢復期血清抗體效價較急性期抗體效價升高4倍或4倍以上為陽性。
B2 型特異性補體結合試驗
B2.1 原理
甲、乙、丙三個型流感病毒各具有特異的可溶性抗原（核蛋白抗原），甲型流感病毒各亞型均具有相同的可溶性抗原，與乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用補體結合試驗來區別它們。當流感病毒出現很大的變異或出現新亞型而引起大流行時，由於來不及充分掌握新分離毒株的性狀，常需同時採用補體結合試驗和血凝抑制試驗對新毒株進行血清學診斷。
B2.2 型特異免疫血清制備
B2.2.1 免疫用抗原
甲型為PR8株和乙型為Lee株均為小鼠適應株。於乙醚麻醉下鼻腔感染12～16g小鼠，每鼠0.05mL，待感染後3～5d大部分小鼠發病、部分死亡時，解剖小鼠。取肺研磨並用生理鹽水製成10%的懸液，低速離心去除粗塊，取上清鼠肺懸液即為免疫用抗原。
B2.2.2 免疫血清制備
選體重300～500g的健康豚鼠，免前采血3～5mL，分離血清分裝凍存留作對照。豚鼠用乙醚輕度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺懸液抗原0.5mL，共免疫3～4次，每次間隔一周，在末次免疫的同時，由腹腔注射鼠肺懸液2mL，一周後試血，如果對同型尿膜抗原的血清效價超過1∶80，而與異型抗原無交叉反應，立即采血分離血清分裝凍存於低溫（-20℃以下）。試驗前血清於56℃水浴滅活30min。
B2.3 可溶性抗原的制備
用甲、乙型流感病毒或新分離病毒按常規接種和收獲尿囊液，如尿液血凝在1∶40以上時，收獲其尿囊膜，將尿囊膜用鹽水洗一次，用無菌剪刀將膜剪成數小塊放入試管中，每個雞胚的尿囊膜加1mL無菌生理鹽水，凍化三次，末次化後以3000r/min離心15min，吸出上清即為可溶性抗原，加入1∶10000的硫柳汞防腐，置4℃冰箱至少可用一個月。
B2.4 雙份血清採集
收集病人急性期（發病3d內）和恢復期（發病10～30d後）的血清。血清於試驗前56℃30min滅活。
B2.5 1%綿羊紅細胞懸液制備、溶血素、補體的制備和滴定按常規方法。
B2.6 補體結合試驗步驟
按常規進行。
B2.7 結果判定
B2.7.1 被檢病毒尿膜抗原與甲型（或乙型）流感病毒免疫血清呈陽性反應則可診斷為甲型（或乙型）流感病毒，如甲、乙均為陰性時，應考慮丙型流感病毒或其他病毒。
B2.7.2 雙份血清對甲型（或乙型）抗原有4倍或4倍以上升高，即可診斷為甲型（或乙型）流感病毒感染。
B2.7.3 正常人群補體結合抗體滴度一般在1∶16以下，如單份恢復期血清抗體在1∶32以上時，結合臨床症狀可作診斷的參考。
B2.7.4 人群血清抗體水平調查中，補體結合抗體在1∶32以上者可作為新近感染流感的證據。
B3 神經氨酸酶抑制試驗
B3.1 原理
胎球蛋白（Fetuin）底物經流感病毒的神經氨酸酶作用後，使N乙醯神經氨酸游離出來，經過碘酸鹽的氧化作用將N乙醯神經氨酸轉化為β－甲醛內酮酸，後者經硫代巴比妥酸作用形成生色團，用有機溶劑提取生色團，並在分光光度計上比色。利用上述反應可測知流感病毒的神經氨酸酶活性，反應的顏色越深酶活性越強。並可選擇用於神經氨酸酶抑制試驗的標准劑量。神經氨酸酶抑制試驗是將標化好劑量的神經氨酸酶(即一定稀釋度的流感病毒尿囊液）和系列稀釋的被檢血清和正常血清起孵育，測知血清作用於神經氨酸酶活性的抑制效價，並計算出血清的神經氨酸酶抑制滴度。
B3.2 器材及試劑
B3.2.1 小試管、10mL吸管及分光光度計等。
B3.2.2 磷酸緩沖液（PBS pH5.9）及生理鹽水。
B3.2.3 胎球蛋白底物液：450～500mg冰凍乾燥的胎球蛋白加蒸餾水10mL，溶解後置4℃保存，每周新配。
B3.2.4 過碘酸鈉溶液：稱4.8g過碘酸鈉（NaIO（下標始）4（下標終)）溶於38mL蒸餾水中，加62mL正磷酸（濃），充分混合，置於棕色磨口瓶中，室溫保存。
B3.2.5 砷試劑：稱10g砷酸鈉（NaAsO（下標始）2（下標終））和7.1g無水硫酸鈉溶於100mL蒸餾水中，加0.3mL濃硫酸，置於帶玻璃塞的瓶中，置4℃保存。
B3.2.6 硫代巴比妥酸試劑：稱1.2g硫代巴比妥酸和14.2g無水硫酸鈉加入200mL蒸餾水中，在煮沸的水浴中加熱溶解，每周新配。
B3.2.7 酸化丁醇試劑：於100mL正丁醇中加入5mL濃鹽酸，置棕色帶玻璃塞的瓶中，室溫保存。
B3.3 神經氨酸酶活性測定
B3.3.1 病毒用生理鹽水做系列倍比稀釋（1∶2～1∶32）分裝小試管，每管0.1mL。標准病毒和未知病毒的神經氨酸酶應在同一試驗中測定。
B3.3.2 每管補充加入0.1mL生理鹽水，再加入0.1mL用pH5.9 PBS配製的胎球蛋白底物，對照管用鹽水代替病毒，充分混合後置37℃水浴作用18h。
B3.3.3 從水浴中取出試管在室溫冷卻，每管加入0.1mL的過碘酸鹽試劑，充分混合，室溫靜置20min（時間要准）。
B3.3.4 每管加入1mL砷試劑，由於碘的釋放出現棕色，搖動試管待棕色消失。
B3.3.5 每管加入2.5mL硫代巴比妥試劑，並充分混合（該試劑需在煮沸溶解後加入），用棉塞將管口堵緊。
B3.3.6 立刻將試管置於煮沸的水浴中，煮沸10min，可見紅色出現，即為神經氨酸酶活性的表現，顏色越深酶活性越高。
B3.3.7 將試管置冰水中冷卻後去掉棉塞，加入4mL丁醇試劑，換上干凈橡皮塞，用手劇烈搖動試管，提取顏色使其轉到有機物（丁醇）相。
B3.3.8 以1500r/min離心5～10min使丁醇層清亮透明，小心地吸出上層的丁醇，放入干凈的試管中待檢。
B3.3.9 將上述受檢樣品由高稀釋度到低稀釋度依次傾入透光池中，其中第一個透光池加入無病毒的對照管液，將分光光度計波長調至549nm，將對照管調至零，然後依次讀取每個稀釋度樣品的光密度。
B3.3.10 酶單位的計算：酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度作為一個酶單位。
B3.4 神經氨酸酶抑制試驗
B3.4.1 按上述方法測定酶活性，選用1個酶單位的病毒稀釋度（即酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度），每管加入0.1mL。
B3.4.2 受檢血清做系列倍比稀釋，每管病毒加入不同稀釋度血清0.1mL，血清對照管是以最低稀釋度血清加生理鹽水代替病毒，37℃水浴作用1h。以同法做正常血清對照組。
B3.4.3 每管加入pH5.9 PBS配製的胎球蛋白0.1mL，充分搖勻，置37℃水浴中孵育18h。
B3.4.4 自水浴中取出試管，按B3.3.3.～B3.3.7逐步加入前述各種試劑。
B3.4.5 測定光密度時應從低稀釋度血清管至高稀釋度血清管，檢測方法同B3.3.9。
B3.5 神經氨酸酶抑制抗體滴度的計演算法
B3.5.1 根據抗血清和正常血清兩組試驗的實驗結果，求得每組血清同一稀釋度的光密度之商數，即為經血清作用後所余之酶活性的百分數。血清稀釋度越高，殘留的酶活性也越高，找出50%酶活性前後兩個血清稀釋度及其相應的酶活性百分數，按公式計算出血清神經氨酸酶抑制抗體滴度。
B3.5.2 計算公式
式中：A——血清神經氨酸酶抑制抗體效價倒數；
B（下標始）1（下標終）——酶活性高於50%的血清稀釋度倒數；
B（下標始）2（下標終）——酶活性低於50%的血清稀釋度倒數；
C（下標始）1（下標終）——高於50%的酶活性的百分數；
C（下標始）2（下標終）——低於50%的酶活性的百分數；
50——常數。
B3.5.3 計算舉例
先計算血清作用後的酶活性：
然後將對數稀釋度換算為幾何稀釋度：例如10（上標始）－3（上標終）換算為1/1000，10（上標始）－3.5（上標終）換算為1/3200。最後代入公式：
此抗血清的神經氨酸酶抑制效價為1∶1440。
流感快速診斷方法
C1 直接檢查呼吸道脫落上皮細胞內抗原
C1.1 原理
由於流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮細胞，因此在病人呼吸道標本的脫落細胞中含有流感病毒抗原，通過直接檢查脫落上皮細胞內抗原即可診斷。檢查方法可採用免疫熒光法，一般於3～4h內即可完成，而且可以直接定型。
C1.2 標本的收集和製片
兒童標本最好採用負壓抽吸法收集呼吸道分泌物，成人標本最好採用鼻咽洗液。可將每份標本分為兩份，一份低溫凍存備作病毒分離，一份用pH7.2磷酸緩沖液（PBS），將粘液吹打散，1500r/min離心15min去除上清，細胞沉澱用PBS洗1～2次，末次離心後棄上清，加入適量pH7.2 PBS使細胞重懸，滴加於帶圈的玻璃片上，自然乾燥，冷丙酮固定10min。
C1.3 間接免疫熒光法
C1.3.1 用10%新鮮羊或牛血清封閉標本片，置濕盒中於37℃30min。
C1.3.2 分別加入適當稀釋度的抗甲型和乙型流感型特異性單克隆抗體，置濕盒中於37℃放置1h。在PBS中洗兩次，共10min。
C1.3.3 加適當稀釋度的兔抗鼠熒光素結合物置37℃1h。在PBS中洗三次，共10min，末次用蒸餾水過一下。
C1.3.4 於熒光顯微鏡下觀察結果，觀察到三個以上胞漿內或胞核內熒光陽性細胞即可判為陽性。
C2 標本經敏感細胞增殖1代後查抗原
C2.1 原理
病人呼吸道標本經接種敏感細胞（狗腎傳代細胞MDCK）增殖1～3d後，將細胞消化分散製成抗原片，再用免疫熒光法或免疫酶染法檢查細胞內抗原。由於標本中的病毒在敏感細胞增殖後查抗原，能明顯提高其診斷的敏感性，可在細胞病變出現以前查到抗原，可以直接定型，而且比常規雞胚分離病毒法要快得多，一般24～72h即可診斷。檢查方法可採用間接免疫酶染法（C2.5）或間接免疫熒光法（C2.4）
C2.2 標本的收集及處理
兒童標本可採用咽拭子，最好採用負壓抽吸法；成人標本可採用咽漱液，最好採用鼻咽洗液。標本按附錄A（標準的附錄）中A2.3方法處理。
C2.3 標本的接種培養及製片
取處理過的標本液0.2mL接種於長成單層的MDCK細胞，每份標本接種3管，置37℃吸附1～2h後棄去標本液，加入每毫升含2μg胰酶的199維持液至1mL，於35℃培養24、48和72h分別取出1管，收集上清備用，將細胞用消化液（1份0.25%胰酶+4份Versene）消化下來，用PBS洗一次，然後滴加於帶圈的玻璃片上，自然乾燥，冷丙酮固定。同法制備未經感染的正常MDCK細胞片即為正常對照細胞。
C2.4 間接免疫熒光法
C2.4.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.4.2 加兔抗鼠熒光素結合物同C1.3.3。
C2.4.3 於熒光顯微鏡下觀察結果，觀察到胞漿內或胞核內熒光，而正常細胞片未見熒光，即可判定為陽性。
C2.5 間接免疫酶染法
C2.5.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.5.2 加適當稀釋度的羊抗鼠酶標結合物，濕盒中置37℃1h，用PBS洗兩次10min。
C2.5.3 加鄰苯二胺底物液，其配製方法為：4mg鄰苯二胺+10mLpH5.0磷酸－檸檬酸緩沖液+15μL雙氧水。pH5.0磷酸緩沖液的配製方法為：先分別配製0.1mol/L檸檬酸（C（下標始）6(下標終）H（下標始）8（下標終）O（下標始）7（下標終）·H（下標始)2（下標終）O）（21g/1000mL）和0.1mol/L磷酸氫二鈉（Na（下標始）2（下標終）HPO（下標始）4（下標終））（28.4g/1000mL），分別按24.3mL和25.7mL混合後，再加入等量（50mL）雙蒸水混合即為pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液。加入底物液3～5min即可觀察結果。
C2.5.4 於倒置顯微鏡下觀察結果（觀察結果時，細胞要濕，如果細胞已干，可以加入一滴自來水），觀察到棕紅色深染細胞，根據觀察到的深染細胞多少記錄為++++、+++、++、+、±、－。以觀察到+以上深染細胞判為陽性；有時可觀察到單個深染細胞被無色或淡紅色細胞所包圍，而正常細胞對照呈無色或淡紅色，亦可判為陽性。